Sepsiszentgyörgy

Munkás útca 16

0267312919 / 0728114900

office@provitam.com

Kézdivásárhely

Béke útca 11

0267364967 / 0728114901

office@provitam.com

Szeben

Someșului útca 11 szám

0267312919 / 0728114902

sibiu@provitam.com

Kolozsvár

Caisului útca 16 szám

0264430175 / 0728114900

office@promedicalcenter.ro

Blog

Koronaposzt 2

2020-08-31, hétfő

Ebben a részben a PCR tesztről lesz szó, annak működéséről és gyakorlati felhasználásáról, a mintavételtől a kiértékelésig, a koronavírus-járvány kontextusába helyezve. Előre figyelmeztetem az olvasót, hogy nem lesz könnyű olvasmány, de próbálok minél közérthetőbben fogalmazni.
A PCR, vagyis a polimeráz-láncreakció egy olyan, rohadt érzékeny módszer, amellyel egy adott DNS-szekvenciát sokszorosítani lehet, akár a kezdeti mennyiség ezermilliárdszorosára. Ez egy nagyon általánosan használható molekuláris biológiai módszer. Attól függően, hogy mire vagyunk kíváncsiak, ki lehet vele mutatni különböző kórokozók jelenlétét a mintában, de akár az emberi génkészletben jelen lévő, betegségeket okozó mutációk is kimutathatók. Ha valakit az érdekelne, hogy milyen színű a páciens szeme, akihez egy adott vérminta tartozik, az is megoldható PCR technikával. Többfajta változata van, koronavírus-diagnosztikában a releváns módszer a reverz transzkripciós realtime PCR változat. Az egész folyamat a mintavételtől a PCR-reakciói végéig a következő lépésekből áll:

  1. Kell egy tisztított minta. Ez, mint tudjuk, koronavírus-tesztelés esetén orrgaratból és/vagy garatból vett mintából nyerhető. Amikor megvakarják az ember nyálkahártyáját a mintavevő pálcikával (“felnyúlnak az agyáig”, ugye), a nyálkahártyáról sejtek több-kevesebb takonnyal együtt a mintavevő pálcára kerülnek, ez pedig egy transzportfolyadékba, aminek a fő tulajdonsága, hogy megőrzi egyben a mintában esetlegesen jelenlevő vírusrészecskéket. A mintavétel helyes módja az, ha a steril pálcikát először az orrgaratba tesszük és nem a folyadékba. Csak azért mondom, mert volt már a megyében példa arra, hogy belemártották a transzportfolyadékba a steril pálcát, aztán azzal vették a mintát, mert hát “őket így tanították”. Nem, nem tanították úgy, hanem csak rosszul értették a dolgot. A transzportfolyadékot nem arra találták ki, hogy azzal nedvesítsék a páciens nyálkahártyáját… No, ez a minta aztán a transzportfolyadékos csőben a laborba kerül, ahol különböző módszerekkel kinyerjük belőle a tisztított DNS-t és RNS-t, ami a mintában volt. A sejtek ugye mindenféle fehérjéket, szerves és szervetlen anyagokat tartalmaznak a nukleinsavakon kívül, ezek a PCR reakciót zavarhatják, ezért szükséges, hogy minél nagyobb tisztaságú DNS-t és RNS-t használjunk a következő lépéshez. A tisztítás rendszerint azon alapszik, hogy ezek a nukleinsavak nagyon erősen elektrosztatikusan töltött molekulák, és ellentétes töltésű felülethez jobban tapadnak, mint a fehérjék. A tisztítás során az adott felületről lemossuk a fölösleges cuccot, majd végül külön oldatba belemossuk a tisztított nukleinsav-elegyet. Ez aztán megy tovább a PCR-reakcióba, koronavírus-teszteléshez tárolni csak rövid ideig lehet, akkor is hűtőben, vagy lefagyasztva, mert az RNS könnyen lebomlik.
  2. A PCR reakció előkészítésénél összekeverünk két oldatot, ún. “master mix”-et készítve, ezt szétosztjuk 0,2 ml-es speciális PCR csövekbe. A master mix-hez ezután hozzáadjuk a tisztított mintát, és mehetnek a csövek a gépbe, amely lefuttatja a PCR-reakciót. A gép működése pofonegyszerű, mást sem csinál, mint bizonyos hőmérsékleten tartja adott ideig a csöveket, aztán ciklikusan változtatja a hőmérsékletet a teszt gyártója által megszabott protokoll szerint, és közben minden ciklus végén több hullámhosszon mér fényjelet (fluoreszcenciát) mindegyik mintából. Ami viszont az egész működés mögött van, az már jóval bonyolultabb:
    A diagnosztikára leginkább használt PCR-tesztek a Taq polimeráz enzim működésén alapulnak, amelyet különböző fluoreszkáló vegyületekkel kombinálnak. Kisebb regényt lehetne írni ezekről külön-külön, de erről most egyelőre annyit, hogy a Taq polimeráz magas hőmérsékleten működik (olyan baktériumból izolálták először, amely 100°C-os vulkanikus tengeralatti források környékén érzi igazán jól magát), és a hőmérsékletek változtatásával ki-be tudjuk kapcsolni ezt az enzimet. Az egyetlen dolga, hogy DNS-t szaporítson, minden ciklus alatt megduplázva a rendelkezésre álló DNS mennyiségét. A PCR trükkje épp az, hogy úgy tervezik meg a teszt többi komponenseit, hogy a polimeráz csak egy vagy több adott génszakaszt szaporítson abból a káoszból, ami a mintában van. Ehhez szükségesek az ún. primer-ek, ezeket úgy tervezik, hogy erősen kapcsolódjanak a detektálni kívánt génszakasz egy részéhez. Ez esetünkben két dolgot jelent: a vírus génszakaszából 3 rövidebb részt, amely csak és kizárólag a koronavírusra jellemző, és ilyen génszakaszok nem találhatóak meg semmilyen egyéb élőlényben. Ilyen génszakaszokat nagyon egyszerű találni, manapság már nagyon sok élőlény teljes genomját ismerjük. Az első lépésben tisztított minta rengeteg fajta DNS-t és RNS-t tartalmaz: nagy mennyiségben azét, akiről a mintát levettük, de ha éppen rántottát reggelizett, akkor a tojás DNS-e is megtalálható benne, mindenféle egyéb baktérium és vírus genetikai anyagával, amely normális esetben éldegél a nyálkahártyán. Lehet benne még egyéb külső cucc is, például a pollenben található nukleinsavak, ha a páciens a mintavétel előtt épp virágot szagolgatott. Ebből a káoszból válogatja ki a PCR a cél-szekvenciát, ami esetünkben a koronavírus genetikai anyagának 3 kisebb része. Ezt úgy kell elképzelni, mintha egy digitális könyvtárban, amely tartalmazza a magyar írók összes művét, meg szeretnénk keresni azokat a könyveket, amelyekben benne van Petőfi Sándor “Anyám tyúkja” című verse. Nem célravezető rákeresni csak egy szóra (pl “kő”), mert az bizony A kőszívű ember fiaiban is benne van, hanem egy egyedi szókombinációval kellene próbálkozni. Valószínűleg elég egy sor a versből (Ej, mi a kő, tyúkanyó kend), ez elég egyedi. A PCR reakcióelegy primer-jei is pontosan ezt csinálják: rátapadnak a vírus DNS-ének bizonyos szakaszára, amely csak és kizárólag a vírusra jellemző. Na de milyen vírus DNS-ről beszélek, amikor mindenki tudja, hogy a koronavírus egy RNS-vírus?? Hát itt jön képbe a PCR reakció első lépése, a reverz transzkripció, amikor egy adott hőmérsékleten a mintában levő RNS molekulák átíródnak DNS-re. Mondtam én, hogy bonyolult. A Taq polimeráz csak DNS-sel foglalkozik, RNS molekulákkal nem, és azokat a részeket szaporítja, amelyekre rá van tapadva az adott primer. Technikailag, egy 3 részt detektálni képes tesztnél 6 primer kell, ehhez még hozzájön 3 fluoreszcens festékkel jelölt génszakasz, amely szintén a primer után kapcsolódik a DNS-szakaszhoz. Amikor megtörténik a DNS-szaporítás, a primerek után pakolgatja a polimeráz a DNS alkotóelemeit olyan sorrendben, ahogy azt a DNS-lánc párján található “betűk” diktálják, és közben ellöki a fluorescens festékkel jelölt génszakaszt, levágva róla a festékanyagot (1. mellékelt kép). Ez pedig jelet ad, azzal arányosan, hogy hány ilyen génszakaszt dob le a DNS-szaporítás közben az enzim. Ez pedig a szaporított DNS mennyiségével egyenesen arányos. Ha még mindig nem vesztette el az olvasó a fonalat, akkor jöhet a detektálás.
    A detektálás úgy történik, hogy besugározza a mintát a gép egy adott hullámhosszú (színű) fénnyel, a szabadon úszkáló festékanyag elnyeli ezt a fényt, majd kibocsát cserébe egy másik hullámhosszú (színű) fényt, amit a gép detektál. Aki volt diszkóban a 90-es években, az tudja, ez mit jelent: az UV-lámpák fényénél bizonyos anyagú pólók fehéren világítottak a sötétben: az ultraibolya fényt elnyelve, látható tartományban sugározták vissza az elnyelt energiát. Minél több festékanyag úszkál szabadon az oldatban, annál erősebb lesz az általa kiadott fény, ezt nevezzük fluoreszcens jelnek. A PCR-görbék tulajdonképpen ennek a jelnek az intenzitását ábrázolják, ahogy változik a 45 PCR ciklus során. A 3 gén esetében 3 különböző festéket alkalmaznak, amelyek 3 különböző színt bocsátanak ki magukból. Minden PCR ciklus megduplázza a szabadon úszkáló festékanyag mennyiségét, amennyiben a keresett vírus darabjai benne vannak a mintában, így egy idő után az alapzajból kiemelkedik, a jel, méghozzá exponenciálisan. Ez az exponenciális emelkedés hasonlít akár a mostani járványgörbe első felére is, de egy idő után ellaposodik, mert kezd elfogyni az oldatból valamelyik alkotóelem, ami a jelet adja, vagy szükséges a DNS szaporításához.
    Na de mi van akkor, ha nem látunk exponenciális jelnövekedést a PCR-reakció során egy-két, vagy akár mind a három génszakaszra? Ez két dolgot jelenthet: az adott mintában nincs jelen a vírus (hurrá, negatív), vagy az adott minta valamiért nem megfelelő. Ha például olyan szennyező anyagok maradnak a mintában, amelyek meggátolják a PCR-reakció legeslegelső lépését, az RNS átírását DNS-re, hiába van tele vírus RNS-sel a minta, ha abból nem lesz DNS, a Taq polimeráz nem tudja szaporítani, így nem lesz jelnövekedés sem. Ezért minden gyártó használ még egy primer-párt, amely olyan génszakaszt szaporít fel a PCR reakció során, ami nem vírus, és benne volt a páciens mintájában a mintatisztítás első lépésében. Ezt vagy beletesszük a mintába (ún. belső kontroll – egy rövid génszakasz, amit hozzáadunk minden mintához), vagy már alapból benne van. Mi olyan tesztet használunk, amely ez utóbbit alkalmazza: a PCR reakció szaporít olyan génszakaszt is, ami egy, emberi sejtekben megtalálható RNS-részlet jelenlétét mutatja ki. Ezt hívják jobb helyeken háztartási génnek: olyan emberi génszakasz, amely minden embernél gyakorlatilag ugyanaz, de nem található meg egy papayában vagy a szomszéd macska nyálában. Ha a PCR-elegyünkbe belekombináljuk ezt a két primert, és egy hozzá tartozó negyedik színű festékanyaggal jelölt génszakaszt, akkor máris van egy olyan kontroll, amivel az egész folyamat minőségét le tudjuk ellenőrizni a minta tisztításától kezdve: ha van ezen a negyedik csatornán exponenciális jelnövekedés, akkor emberi mintával van dolgunk, és ha ez a jelnövekedés adott ciklus előtt elkezdődik, akkor a minta mennyisége is megfelelőnek minősíthető. Így, ha a másik 3 csatornán nincsen jelnövekedés, akkor a minta a vizsgált vírusra negatív. Valószínűleg innen ered “a koronavírus mindenkiben benne van”-téveszme, ugyanis minden negatív mintánál kell lássunk egy jelnövekedést a háztartási génhez, vagy más belső kontrollhoz tartozó csatornán ahhoz, hogy biztosak legyünk benne, tényleg nincs vírus a mintában, és nem az történt, hogy elfuseráltuk az első tisztítási lépést, vagy épp nem akart megviccelni minket egy afrikai ország elnöke, hogy aztán alázhassa a PCR-tesztelést.
    És itt teszünk egy kis kitérőt. Tudta ön, hogy minden ember DNS-ének jelentős része ősi vírusok genetikai információjából áll össze? Ezek a humán endogén retrovírusok, amelyek beépültek az evolúció során a DNS-ünkbe, részlegesen vagy teljesen. A DNS-állomány kb 8%-a ősi retrovírusok szekvenciájából áll, és ezek néhány kulcsfontosságú helyen aktivizálódnak is, például a placentában. Ha a részleges beépüléseket nézzük, akkor a genetikai anyagunk fele olyan szekvenciákból áll össze, amelyek ősi vírusok darabjai lehettek egykor (ún. transzpozómák). Ön dönt. Ember, vagy vírus?
    A figyelmes olvasó a következő kínzó kérdéseket fogalmazhatja meg, amelyet válaszokkal együtt alább tálalok:
  • Honnan tudjuk, hogy megfelelően működik a master mixben levő cucc, és ha van vírus, tényleg ad jelet a 3 csatornából egy vagy több? Na erre van a pozitív kontroll, ami olyan oldat, amit mintaként kezelünk és minden esetben jelet kell adjon az összes csatornán.
  • Honnan tudjuk, hogy egy pozitív minta tényleg pozitív, és nem azért pozitív, mert például a felhasznált pipetta felszívta egy nagyon fertőző személy mintáját és összefertőztük a többi mintát? Na erre van a negatív kontroll, ami olyan oldat, ami tutira nem ad jelet egyik csatornán sem, ilyent is kell alkalmazni minden PCR-reakcióban. Ha mégis van jel valamelyik csatornán, az utal kontaminációra, és olyankor összevont szemöldökkel kell nézni arra a személyre, aki a PCR-elegyet összerakta.
  • Honnan tudjuk, hogy sok vírus van vagy kevés a mintában? Ez abból látszik, hogy hányadik ciklusnál válik el a jel a zajtól – hol kezdődik a görbe exponenciális növekedése. Minél kevesebb ez a ciklusszám, annál több volt a tisztított mintában a kiindulási vírusmennyiség. Ha valakinek pl. a 14. ciklusnál van exponenciális jelnövekedés, annak egymilliószor több vírust tartalmazott a mintája, mint akinek a 34. ciklusnál kezdődik a jelnövekedés.
  • Számít a mintában található vírus mennyisége a teszteredmény szempontjából egyáltalán? Nem, ha van bármennyi detektálható vírus, az eredmény pozitív. Én viszont el szoktam mondani a pácienseknek, hogy sok vagy kevés vírus volt a mintájukban, amennyiben ez őket érdekli, de azt is, hogy milyen faktorok befolyásolhatják a vírus mennyiségét az adott mintában.
    Egy vérprofi koronavírus-tesztelő (tulajdonképpen mindenki, aki már hónapok óta koronavírus-teszteket értékel ki) nem is a PCR-görbét nézi (ismételjünk: a PCR görbe vízszintes tengelyén a ciklusszám van, a függőleges tengelyén pedig a jelintenzitás – 2., 4. és 6. mellékelt ábra), hanem ennek a görbének az alapvonallal korrigált változatát logaritmikus skálán, tehát azt, hogy hogyan változik a görbe a ciklusok számával (3., 5., 7. ábra). A rutin diagnosztikában tehát ezeket a görbéket figyeljük. Ha nincs exponenciális jelnövekedés, az korrigált fluoreszcencia érték össze-vissza ugrál adott határokon belül, de amint jelnövekedés van, a logaritmikus ábrán egy egyenest kapunk, amely egy idő után “elhajlik”, amint kezd kifogyni a szufla a rendszerből a ciklusszám növekedésével.
    A mellékelt ábrák (az első kivételével) különböző PCR-görbéket mutatnak, fertőző és kevésbé fertőző páciensektől, ill. negatív mintákból. A zöld görbe a belső kontroll jele, a három másik szín a 3 detektált génszakaszhoz tartozó jel.
    A következő részben azt boncolgatom, hogy a tesztelés elindításával milyen kudarcélményeink voltak, hiszen ezek is szervesen hozzátartoznak egy kutatólaboratórium munkájához. Kudarc nélkül nincs siker, ugye, de ezek már Coelho-i magasságok. Szó lesz még a szürke zónáról: mikor mondjuk azt, hogy egy minta a detektálhatóság határán tartalmaz vírust, és mi alapján döntjük el, hogy ilyen mintát pozitívnak vagy negatívnak adunk ki.
covid19 koronaposzt koronavírus